Pada 1942, dia sempat ditangkap serdadu Jepang yang mencurigainya sebagai mata-mata Belanda, lantaran postur badannya yang kekar. Dia kemudian bekerja sebagai dokter gigi untuk pemerintah Jepang, sebelum memutuskan masuk pelatihan militer.
Dirinya menerima pelatihan militer di Bogor bersama Sudirman dan Gatot Subroto, di mana mereka mendapat peringkat tertinggi di kelasnya. Selama pelatihan, Moestopo berhasil menggabungkan ilmu kedokteran dengan ilmu strategi perang.
Karena otaknya yang cemerlang, Moestopo langsung diangkat sebagai komandan Pembela Tanah Air (PETA) di Sidoarjo setelah lulus pelatihan militer. Dirinya kemudian beliau diangkat menjadi komandan pasukan yang mengamankan daerah Gresik dan Surabaya.
Tidak banyak orang Indonesia yang menerima promosi jabatan ini, cuma lima orang, dan Moestopo adalah salah satunya. Hingga titik ini, Moestopo memang tampaknya pantas menyandang tugas sebagai tentara.
